Основными методами цитологических исследований являются световая и электронная микроскопия , т. е. использование световых и электронных микроскопов, позволяющих увидеть внешнее и внутреннее строения клеток.

Световые микроскопы позволяют в том числе наблюдать и за живыми клетками (обычно для этого используются одноклеточные организмы, клетки крови). Однако разрешающая способность световых микроскопов не так велика как у электронных. Разрешающая способность увеличительного прибора - это минимальное расстояние между двумя видимыми отдельно точками. У световых микроскопов это расстояние измеряется сотнями нанометров, а у электронных - десятками и единицами нанометров. Если в первых используется световой поток (разрешающая способность обратнопропорционально зависит от длины волны), то во вторых - поток электронов.

Существует два вида электронных микроскопов - просвечивающие и сканирующие. Разрешающая способность первых несколько выше, однако с помощью вторых можно получить объемное изображение. Для просвечивающих микроскопов готовят очень тонкие срезы, через которые проходит пучок электронов. В сканирующих микроскопах пучок электронов отражается от объекта.

В цитологических исследованиях также используется метод флуоресцентной микроскопии , который заключается в том, что к живым клеткам добавляются определенные красящие вещества, которые, соединяясь с различными компонентами клетки, начинают светиться. Таким образом, можно в световой микроскоп наблюдать клеточные структуры (хлоропласты, микротрубочки и др.).

Кроме микроскопии в современной цитологии используются и другие методы исследования. Цитохимический метод позволяет изучать химический состав клеток. Данный метод базируется на химических реакциях определенных веществ. Добавляя реагенты к клеткам, можно выявить наличие в них ДНК, определенных белков и др., а также определить их количество.

Метод радиоавтографии предполагает введение вещества, содержащего меченые (радиоактивные) атомы. Меченые молекулы через некоторое время включаются в биополимеры клетки, и по ним можно отследить протекание метаболических процессов в клетке.

С 20-х годов XX века хорошо известен такой метод цитологических исследований как центрифугирование (или метод фракционирования клеточных структур) . Он основан на том, что клеточные структуры имеют разную массу и при центрифугировании осаждаются с разной скоростью. Таким образом, если разрушить клетки, то после центрифуги смесь разделится на фракции, где внизу будут находиться более тяжелые структуры (обычно это клеточные ядра), а вверху - более легкие.

Относительно новым является метод клеточных культур , позволяющий вне организма в специально созданных условиях выращивать одинаковые клетки (колонии) из одной или нескольких исходных. Данный метод позволяет отдельно от организма изучать свойства его клеток, проводить цитологические, генетические и другие исследования.

Новым методом цитологических исследования является метод микрохирургии . С помощью микроманипулятора, соединенного с микроскопом, из клеток извлекают или вносят различные компоненты, вводят вещества.

Клеточный уровень организации жизни

§ 16. История изучения клетки. Методы цитологических исследований.

История изучения клетки.

Мир клеток оставался полностью неизвестным до середины XVII в., пока люди не научились шлифовать линзы и использовать их для расширения возможностей зрения.

Одним из первых создателей микроскопа был Роберт Гук физик, метеоролог, биолог, инженер, архитектор. В 1665 г. он издал альбом рисунков под названием «макрография», в котором были представлены его наблюдения под микроскопом.

Одним из одаренных современников Гука был голландец Антони ван Левенгук, который создал 200 микроскопов собственной особой конструкции. Левенгук добился увеличения объектов в 270 раз и сделал выдающиеся открытия.

Роберт Броун в 1833 г. открыл в клетке ядро. После 1825 г. Ян Пуркинье разработал эффективные методики приготовления и окраски препаратов для микроскопической техники.

Клеточную теорию предложил для растений в 1837 г. немецкий ботаник Матиас Шлейден, а распространил на животный мир его друг, физиолог Теодор Шванн. Несколько позже ее дополнил Рудольф Вирхов, который в 1885 г. сформулировал положение «Каждая клетка происходит из клетки».

В середине XIX в. клеточная теория стала общепризнанной и основой для науки о клетке - цитологии. К концу XIX в. было открыто много компонентов клеток. Ученые описали их и дали им названия.

Но в 1945 г. цитологи впервые заглянули в клетки с помощью электронного микроскопа и увидели много неизвестных ранее структур. Итак, решающая роль в развитии цитологии принадлежит новым открытием в других науках, в частности в физике.

Методы цитологических исследований.

Основным методом является метод световой микроскопии. Он предусматривает применение светового микроскопа, но рассмотреть под световым микроскопом можно только специально приготовленные цитологические препараты.

Для приготовления препаратов цитологи используют предметные стекла и специально подготовленные объекты, которые можно рассматривать.

Чаще всего эти структуры бесцветные, поэтому их необходимо красить специальными красителями, каждый раз разными, в зависимости от того, какие структуры желательно увидеть.

Существуют два метода: метод приготовления давлений препаратов - исследуемый объект просто раздавливается в один слой между предметным и накрывным стеклом, и метод приготовления тонких срезов, состоящие из одного слоя клеток.

Для изучения живых клеток применяют метод фазово-контрастной микроскопии. Он базируется на том, что отдельные участки прозрачной клетки отличаются друг от друга по плотности и светопреломления.

Изучая живые клетки, применяют также метод флуоресцентной микроскопии. Смысл его заключается в том, что целый ряд веществ обладают способностью светиться при поглощении ими световой энергии. Например, если в флуоресцентный микроскоп рассматривать клетки растений, то на темно-синем теле будет видно красные зерна, ярко светятся, - это хлоропласты.

Существует метод, в котором используются меченые изотопы - метод авторадиографии - регистрации веществ, меченных изотопами. С помощью этого метода можно увидеть, к каким частям клетки попадают вещества, меченные радиоактивными изотопами.

Метод электронной микроскопии открыл цитолог те структуры клетки, которые имеют размеры, меньше длины световой волны. Благодаря этому методу появилась возможность рассмотреть вирусы и органеллы, на которых происходит синтез белка (рибосомы).

Цитологи могут также получать и изучать различные компоненты клеток с помощью фракционирования клеток. Клетку сначала разрушают, а затем выделяют клеточные структуры, используя специальное устройство - центрифугу.

Метод использования культуры клеток является методом длительного хранения и выращивания в специальных питательных средах клеток, тканей, небольших органов или их частей, выделенных из организма человека, животного или растения. Важным преимуществом этого метода является возможность наблюдения за жизнедеятельностью клеток с помощью микроскопа.

Значение цитологических методов в диагностике и лечении заболеваний человека.

1) Цитологические методы применяются в медицине для исследования физиологического состояния организма человека на основе изучения строения клеток. Они используются для выявления заболеваний крови, распознавания злокачественных и доброкачественных опухолей, многих заболеваний органов дыхания, пищеварения, мочевыделения, нервной системы и их лечение.

2) Стволовая клетка - это незрелая клетка, способная к самообновлению и развитию в специализированные клетки организма. Во взрослом организме стволовые клетки содержатся в основном в костном мозге и в очень небольшом количестве во всех органах и тканях. Их можно использовать для лечения многих заболеваний.

§ 17. Строение клеток прокариот и эукариот.

Единство строения клеток.

Содержание любой клетки отделен от внешней среды особой структурой - плазматической мембраной (плазмалемма). Эта обособленность позволяет создавать внутри клетки совсем особая среда, не похоже на то, что его окружает. Поэтому в клетке могут происходить те процессы, которые не происходят нигде, их называют процессами жизнедеятельности.

Внутренняя среда живой клетки, ограниченное плазматической мембраной, называется цитоплазмой. Она включает гиалоплазму (основную прозрачную вещество) и клеточные органеллы, а также различные непостоянные структуры - включения. К органелл, которые есть в любой клетке, относятся также рибосомы, на которых происходит синтез белка.

Строение клеток эукариот.

Эукариоты - это организмы, клетки которых имеют ядро. Ядро - это самая органеллы эукариотической клетки, в которой хранится и из которой переписывается наследственная информация, записанная в хромосомах. Хромосома - это молекула ДНК, интегрированная с белками. В ядре содержится ядрышко - место, где образуются другие важные органеллы, участвующих в синтезе белка - рибосомы. Но рибосомы только формируются в ядре, а работают они (т.е. синтезируют белок) в цитоплазме. Часть из них находится в цитоплазме свободно, а часть прикрепляется к мембран, образуют сетку, которая получила название эндоплазматической.

Рибосомы - немембранни органеллы.

Эндоплазматическая сеть - это сеть канальцев, ограниченных мембранами. Существует два типа: гладкая и гранулярная. На мембранах гранулярной эндоплазматической сети расположены рибосомы, поэтому в ней происходит синтез и транспортировки белков. А гладкая эндоплазматическая сеть - это место синтеза и транспортировки углеводов и липидов. На ней рибосом нет.

Для синтеза белков, углеводов и жиров необходима энергия, которую в эукариотической клетке производят «энергетические станции» клетки - митохондрии.

Митохондрии - двомембранни органеллы, в которых осуществляется процесс клеточного дыхания. На мембранах митохондрий окисляются органические соединения и накапливается химическая энергия в виде особых энергетических молекул (АТФ).

В клетке также есть место, где органические соединения могут накапливаться и откуда они могут транспортироваться, - это аппарат Гольджи, система плоских мембранных мешочков. Он участвует в транспортировке белков, липидов, углеводов. В аппарате Гольджи образуются также органеллы внутриклеточного пищеварения - лизосомы.

Лизосомы - одномембранни органеллы, характерные для клеток животных, содержат ферменты, которые могут расщеплять белки, углеводы, нуклеиновые кислоты, липиды.

В клетке могут быть органеллы, не имеющие мембранной строения, например рибосомы и цитоскелет.

Цитоскелет - это опорно-двигательная система клетки, включает микрофиламенты, реснички, жгутики, клеточный центр, который производит микротрубочки и центриоли.

Существуют органеллы, характерные только для клеток растений, - пластиды. Бывают: хлоропласты, хромопласты и лейкопласты. В хлоропластах происходит процесс фотосинтеза.

В клетках растений также вакуоли - продукты жизнедеятельности клетки, являющиеся резервуарами воды и растворенных в ней соединений. В эукариотических организмов относятся растения, животные и грибы.

Строение клеток прокариот.

Прокариоты - одноклеточные организмы, в клетках которых нет ядра.

Прокариотические клетки малы по размерам, сохраняют генетический материал в форме кольцевой молекулы ДНК (нуклеоидом). В прокариотических организмов относятся бактерии и цианобактерии, которые раньше называли сине-зелеными водорослями.

Если в прокариот происходит процесс аэробного дыхания, то для этого используются специальные выпячивание плазматической мембраны - мезосомы. Если бактерии фотосинтезирующие, то процесс фотосинтеза происходит на фотосинтетических мембранах - тилакоидов.

Синтез белка в прокариот происходит на рибосомах. В прокариотических клетке мало органелл.

Гипотезы происхождения органелл эукариотических клеток.

Прокариотические клетки появились на Земле раньше, чем эукариотические.

1) симбиотические гипотеза объясняет механизм возникновения некоторых органоидов эукариотической клетки - митохондрий и фотосинтезирующих пластид.

2) Инвагинацыонная гипотеза - утверждает, что происхождение эукариотической клетки исходит из того, что предковой формы был аэробный прокариот. Органеллы в нем возникли в результате впячивания и отслоение частей оболочки с последующей функциональной специализацией в ядро, митохондрии, хлоропласты других органелл.

§ 18. Клеточные мембраны. Транспортировки веществ через мембраны. Поверхностный аппарат клетки, его функции.

Клеточные мембраны.

Биологические мембраны - это тонкие смежные структуры молекулярных размеров, расположенные на поверхности клеток и субклеточных частей, а также канальцев и пузырьков, пронизывающих протоплазму. Функция биологических мембран - регулирование транспортировки ионов, сахаров, аминокислот и других продуктов обмена веществ.

В основе любой мембраны лежит двойной слой фосфолипидов.

Однако билипидный слой - это еще не готова мембрана, а лишь ее основа. С билипидного слоем должны связаться белки, называемые мембранными белками. Именно мембранные белки определяют многие свойства мембран. Входят в состав мембран и углеводы, образуют комплексы с белками или липидами. Мембрана состоит из слоя билипидив, в котором плавают (или закреплены) белковые молекулы, образуя в нем своеобразную мозаику.

Строение мембраны соответствует ее функциям: транспортной, барьерной и рецепторной.

1) Барьерная функция. Мембрана является барьером, который предотвращает поступление в клетки различных химических веществ и других агентов.

2) Рецепторные функции. Поверхность мембраны имеет большой набор рецепторов, делающих возможными специфические реакции с различными агентами.

3) Транспортная функция. Через мембрану идет транспорт ионов и веществ.

Покрывая клетку и отделяя ее от окружающей среды, биологические мембраны обеспечивают целостность клеток и органелл. Она поддерживает неравномерное распределение ионов калия, натрия, хлора и других ионов между протоплазмой и окружающей средой.

Особенно важной мембраной в клетке является плазмалемма - поверхностная мембрана. Она выполняет барьерную, транспортную, рецепторную, сигнальную функции.

Транспортировки веществ через мембраны.

Существуют два активных процесса: экзоцитоз и эндоцитоз.

Из клетки вещества выводятся с помощью экзоцитоза - слияние внутриклеточных пузырьков с плазматической мембраной. В клетку вещества могут попадать посредством эндоцитоза. В процессе эндоцитоза плазматическая мембрана образует вогнутости и вырасти, которые потом, отслаивая, превращаются в пузырьки или вакуоли.

Различают два типа эндоцитоза:

- Пиноцитоз - поглощение жидкости и растворенных веществ с помощью небольших пузырьков;

- Фагоцитоз - поглощение крупных частиц, таких как микроорганизмы или остатки клеток.

В случае фагоцитоза образуются большие пузыри, которые называются вакуолями.

Молекулы проходят через мембраны благодаря процессам: простой диффузии, облегченной диффузии, активному транспортировке.

Простая диффузия - это пример пассивного транспортировки, проходит из зоны с большей концентрацией молекул в зону с меньшей концентрацией. Путем простой диффузии в клетку проникают неполярные (гидрофобные) вещества, растворимые в липидах, и мелкие незаряженные молекулы (например, вода). Однако большинство веществ переносится через мембрану с помощью погруженных в нее транспортных белков. Различают две формы обращения: облегченная диффузия и активное транспортировки.

Облегченная диффузия обусловлена ​​градиентом концентрации, и молекулы движутся согласно этому градиента. Однако молекула заряжена, то на ее транспортировку влияет как градиент концентрации, так и мембранный потенциал.

Активное транспортировки - это перенос растворенных веществ против градиента концентрации с использованием энергии АТФ. Энергия необходима потому, что вещество должно двигаться, вопреки своему естественному стремлению двигаться по диффузией, в противоположном направлении. Примером может служить натрий-калиевый насос. По законам диффузии ионы Nа постоянно движутся внутрь клетки, а ионы К + - из клетки. Нарушение необходимой концентрации этих ионов влечет за-гибель клетки.

Поверхностный аппарат клетки.

Разновидность клеток прокариот и эукариот состоит из частей: поверхностного аппарата, цитоплазмы, ядерного аппарата.

Поверхностный аппарат клетки выполняет три функции, универсальные для всех видов клеток: барьерную, транспортную, рецепторную. Он может осуществлять и ряд специфических функций (например, механическая тургорного функция клеточной стенки в растительных клетках). Поверхностный аппарат клеток состоит из систем: плазматической мембраны, надмембранный комплекса и субмембранного (т.е. пидмембранного) опорно-сократительного аппарата.

Плазматическая мембрана, или плазмалемма, - это основная, универсальная для всех клеток система поверхностного аппарата. Под ней расположена субмембранна система, которая участвует в трансмембранному транспортировке и рецепции и является частью цитоплазмы.

Надмембранная структура поверхностного аппарата осуществляют взаимодействие клеток с внешней средой или с другими клетками. У клеток животных надмембранный комплекс, или гликокаликс, играет важную роль в рецепторной функции клеток. Гликокаликс состоит из углеводов, он сравнительно тонкий и эластичный.

К производным надмембранным структурам принадлежит клеточная стенка. Ее должны клетки растений, грибов и бактерий. Клеточная стенка растений содержит целлюлозу, грибов - хитин, бактерий - муреин. Она достаточно жесткая, не сжимается. Через клеточную стенку проходит вода, соли, молекулы многих органических веществ. Явление плазмолиза и деплазмолиза в клетках растений.

Плазмолиз - это отделение цитоплазмы от оболочки при погружении клетки в гипертонический, т.е. концентрированные извне, раствор. Если животные клетки погрузить в гипертонический раствор, то они сжимаются. Иногда плазмолизованые клетки остаются живыми. Если погрузить такие клетки в воду, в которой концентрация солей ниже, чем в клетке, происходит деплазмолиз.

Деплазмолиз - это возвращение цитоплазмы клеток растений из состояния плазмолиза в исходное состояние.

Мурманскийгосударственный технический университет

Кафедра биологии

Доклад на тему:

«Методыисследования в цитологии»

Выполнил:

Студентка 1-го курса

Технического факультета

Кафедры Биология

Серебрякова ЛадаВячеславовна

Проверил:

Мурманск2001

План:

1.Что изучает цитология.

2.Представление о том, что организмы состоят из клеток.

3.Методы исследования, применяемые в цитологии.

4.Фракционирование клеток.

5.Радиоавтография.

6.Определение продолжительности некоторых стадий клеточного цикла методомрадиоавтографии.

Цитология –наука о клетке. Из среды других биологических наук она выделилась почти 100 летназад. Впервые обобщенные сведения о строении клеток были собраны в книгуЖ.-Б. Карнуа «Биология клетки», вышедшей в 1884 году. Современная цитологияизучает строение клеток, их функционирование как элементарных живых систем:исследуются функции отдельных клеточных компонентов, процессы воспроизведенияклеток, их репарации, приспособление к условиям среды и многие другие процессы,позволяющие судить об общих для всех клеток свойствах и функциях. Цитологиярассматривает также особенности строения специализированных клеток. Другимисловами, современная цитология – это физиология клетки. Цитология тесносопряжена с научными и методическими достижениями биохимии, биофизики,молекулярной биологии и генетики. Это послужило основанием для углубленногоизучения клетки уже с позиций этих наук и появления некой синтетической науки оклетке – биологии клетки, или клеточной биологии. В настоящее время терминыцитология и биология клетки совпадают, так как их предметом изучения является клеткас ее собственными закономерностями организации и функционирования. Дисциплина«Биология клетки» относится к фундаментальным разделам биологии, потому что онаисследует и описывает единственную единицу всего живого на Земле – клетку.

Длительное и пристальноеизучение клетки как таковой привело к формулированию важного теоретическогообобщения, имеющего общебиологическое значение, а именно к появлению клеточнойтеории. В XVII в. Роберт Гук,физик и биолог, отличавшийся большой изобретательностью, создал микроскоп.Рассматривая под своим микроскопом тонкий срез пробки, Гук обнаружил, что онапостроена из малюсеньких ничем не заполненных ячеек, разделенных тонкимистенками, которые, как это нам теперь известно, состоят из целлюлозы. Он назвалэти маленькие ячейки клетками. В дальнейшем, когда другие биологи началиисследовать под микроскопом растительные ткани, оказалось, что маленькиеячейки, обнаруженные Гуком в мертвой иссохшей пробке, имеются и в живыхрастительных тканях, но у них они не пустые, а содержат каждая по маленькомустуденистому тельцу. После того, как микроскопическому исследованию подверглиживотные ткани, было установлено, что они также состоят из мелких студенистыхтелец, но что эти тельца лишь в редких случаях отделены друг от друга стенками.В результате всех этих исследований в 1939 г. Шлейден и Шванн независимо другот друга сформулировали клеточную теорию, гласящую, что клетки представляютсобой элементарные единицы, из которых в конечном счете построены все растенияи все животные. В течение какого-то времени двоякий смысл слова клетка ещевызывал некоторые недоразумения, но затем он прочно закрепился за этимималенькими желеобразными тельцами.

Современное представление оклетке тесно связано с техническими достижениями и усовершенствованиями методовисследования. Помимо обычной световой микроскопии, не утратившей своей роли, впоследние несколько десятилетий большое значение приобрели поляризационная,ультрафиолетовая, флюоресцентная, фазовоконтрастная микроскопия. Среди них особоеместо занимает электронная микроскопия, разрешающая способность которойпозволила проникнуть и изучить субмикроскопическую и молекулярную структуруклетки. Современные методы исследования позволили вскрыть детальную картинуклеточной организации.

Каждая клеткасостоит из ядра и цитоплазмы, отделенных друг от друга и от внешней средыоболочками. Компонентами цитоплазмы являются: оболочка, гиалоплазма,эндоплазматическая сеть и рибосомы, аппарат Гольджи, лизосомы, митохондрии,включения, клеточный центр, специализированные органеллы.

Часть организма, выполняющаякакую-то особую функцию, называют органом. Любой орган – легкое, печень, почка,например – имеет каждый свою особую структуру, благодаря которой он играетопределенную роль в организме. Точно так же в цитоплазме имеются особыеструктуры, своеобразное строение которых дает им возможность нести определенныефункции, необходимые для метаболизма клетки; эти структуры называют органеллами(«маленькими органами»).

Выяснениеприроды, функции и распределения органелл цитоплазмы стало возможным лишь послеразвития методов современной биологии клетки. Наиболее полезными в этом отношении оказались: 1) электронная микроскопия; 2) фракционирование клеток, спомощью которого биохимики могут выделять относительно чистые фракции клеток,содержащие определенные органеллы, и изучать, таким образом, отдельныеинтересующие их метаболические реакции; 3) радиоавтография, сделавшая возможнымнепосредственное изучение отдельных метаболических реакций, протекающих в органеллах.

Метод, с помощьюкоторого органеллы выделяют из клеток, называют фракционированием. Этот методоказался очень плодотворным, дав биохимикам возможность выделять разныеорганеллы клетки в относительно чистом виде. Он позволяет, кроме того,определять химический состав органелл и содержащиеся в них ферменты и наосновании получаемых данных делать выводы об их функциях в клетке. В качествепервого шага клетки разрушают путем гомогенизации в какой-нибудь подходящейсреде, которая обеспечивает сохранность органелл и предотвращает их агрегацию.Очень часто для этого используют раствор сахарозы. Хотя митохондрии и многиедругие клеточные органеллы остаются при этом неповрежденными, такие мембранныепереплетения, как эндоплазматический ретикулум, а также плазматическаямембрана, распадаются на фрагменты. Однако образующиеся фрагменты мембраннередко замыкаются сами на себя, в результате чего получаются округлые пузырькиразличных размеров.

На следующемэтапе клеточный гомогенат подвергают ряду центрифугирований, скорость ипродолжительность которых всякий раз возрастает; этот процесс называетсядифференциальным центрифугированием. Разные органеллы клетки осаждаются на днецентрифужных пробирок при различных скоростях центрифугирования, что зависит отразмеров, плотности и формы органелл. Образующийся осадок можно отобрать иисследовать. Быстрее всех осаждаются такие крупные и плотные структуры, какядра, а для осаждения более мелких и менее плотных структур, таких, какпузырьки эндоплазматического ретикулума, требуются более высокие скорости иболее длительное время. Поэтому при низких скоростях центрифугирования ядраосаждаются, а другие клеточные органеллы остаются в суспензии. При болеевысоких скоростях осаждаются митохондрии и лизосомы, а при длительном центрифугированиии очень высоких скоростях в осадок выпадают даже такие мелкие частицы, какрибосомы. Осадки можно исследовать с помощью электронного микроскопа, чтобыопределить чистоту полученных фракций. Все фракции до некоторой степенизагрязнены другими органеллами. Если тем не менее удается добиться достаточнойчистоты фракций, то их подвергают затем биохимическому анализу, чтобыопределить химический состав и ферментативную активность выделенных органелл.

Сравнительнонедавно был создан другой метод фракционирования клеток – центрифугирование вградиенте плотности; при этом центрифугирование производят в пробирке, вкоторой предварительно наслаивают друг на друга растворы сахарозы всевозрастающей концентрации, а следовательно, и возрастающей плотности. Прицентрифугировании содержащиеся в гомогенате органеллы располагаются вцентрифужной пробирке на тех уровнях, на которых находятся растворы сахарозы,соответствующие им по плотности. Этот метод дает биохимикам возможностьразделять органеллы одинаковых размеров, но разной плотности (рис. 1.).

Радиоавтография– сравнительно новый метод, безмерно расширивший возможности как световой, таки электронной микроскопии. Это в высшей степени современный метод, обязанныйсвоим возникновением развитию ядерной физики, которое сделало возможнымполучение радиоактивных изотопов различных элементов. Для радиоавтографиинеобходимы, в частности, изотопы тех элементов, которые используются клеткойили могут связываться с веществами, используемыми клеткой, и которые можновводить животным или добавлять к культурам в количествах, не нарушающихнормального клеточного метаболизма. Поскольку радиоактивный изотоп (илипомеченное им вещество) участвует в биохимических реакциях так же, как егонерадиоактивный аналог, и в то же время испускает излучение, путь изотопов ворганизме можно проследить с помощью различных методов обнаружениярадиоактивности. Один из способов обнаружения радиоактивности основан на ееспособности действовать на фотопленку подобно свету; но радиоактивное излучениепроникает сквозь черную бумагу, используемую для того, чтобы защититьфотопленку от света, и оказывает на пленку такое же действие, как свет.

Чтобы на препаратах,предназначенных для изучения с помощью светового или электронного микроскопов,можно было обнаружить излучение, испускаемое радиоактивными изотопами,препараты покрывают в темном помещении особой фотоэмульсией, после чегооставляют на некоторое время в темноте. Затем препараты проявляют (тоже втемноте) и фиксируют. Участки препарата, содержащие радиоактивные изотопы,воздействуют на лежащую над ними эмульсию, в которой под действием испускаемогоизлучения возникают темные «зерна». Таким образом, получают радиоавтографы (отгреч. радио – лучевидный, аутос – сам и графо – писать).

Вначале гистологи располагалилишь несколькими радиоактивными изотопами; так, например, во многих раннихисследованиях с применением радиоавтографии использовался радиоактивный фосфор.Позднее стали использовать значительно больше таких изотопов; особенно широкоеприменение нашел радиоактивный изотоп водорода – тритий.

Радиоавтографияимела и имеет до сих пор очень широкое применение для изучения того, где и какв организме протекают те или иные биохимические реакции.

Химическиесоединения, меченые радиоактивными изотопами, которые используются дляисследования биологических процессов, называют предшественниками.Предшественники – это обычно вещества, подобные тем, которые организм получаетиз пищи; они служат строительными блоками для построения тканей и включаются всложные компоненты клеток и тканей таким же образом, как в них включаютсянемеченые строительные блоки. Компонент ткани, в который включается меченыйпредшественник и который испускает излучение, называется продуктом.

Клетки,выращиваемые в культуре, хотя и принадлежат к одному и тому же типу, в любойданный момент времени будут находиться на разных стадиях клеточного цикла, еслине принять специальных мер для синхронизации их циклов. Тем не менее, путемвведения в клетки тритий-тимидина и последующего изготовления радиоавтографовможно определить продолжительность различных стадий цикла. Время наступленияодной стадии – митоза – можно определить и без меченого тимидина. Для этоговыборку клеток из культуры держат под наблюдением в фазово-контрастноммикроскопе, который дает возможность непосредственно следить за течением митозаи устанавливать его сроки. Продолжительность митоза обычно равна 1 ч, хотя вклетках некоторых типов он занимает до 1.5 ч.

Определениепродолжительности G 2-периода .

Для определенияпродолжительности G 2–периода применяют метод, известный под названием импульснойметки: к культуре клеток добавляют меченый тимидин, а спустя короткоевремя заменяют культуральную среду свежей, с тем, чтобы предотвратитьдальнейшее поглощение клетками меченого тимидина. При этом метку включаюттолько в те клетки, которые в течение кратковременного пребывания в среде с тритий-тимидином находились в S-периоде клеточного цикла. Доля такихклеток невелика и лишь небольшая часть клеток получит метку. Кроме того, всеклетки, включающие метку, будут находиться в интерфазе – от клеток, едвавступивших в S-период, дотаких, которые почти закончили его за время воздействия тритий-тимидина. Впробе, взятой сразу после удаления меченого тимидина, метка содержится только винтерфазных ядрах, принадлежащих клеткам, которые в период воздействия меткинаходились в S-периоде; те жеклетки, которые в этот период находились в состоянии митоза, остаютсянемечеными.

Если затем продолжать отбиратьиз культуры пробы через определенные промежутки времени и изготовлять длякаждой последовательной пробы радиоавтограф, то наступит момент, когда метканачнет появляться в митотических d -хромосомах . Метки будутвключаться во все те клетки, которые в период наличия в среде тритий-тимидинанаходились в S-периоде, причемсреди этих клеток будут как только что вступившие в S-период, так ипочти закончившие его. Совершенно очевидно, что эти последние первыми средимеченых клеток проделают митоз и, следовательно, в их митотических хромосомахобнаружится метка. Тем самым промежуток между 1) временем, когда из культурыбыл удален меченый тимидин, и 2) временем появления меченых митотическиххромосом будет соответствовать продолжительности G 2–периодаклеточного цикла.

Определениепродолжительности S -периода .

Поскольку клетки, находящиесяв момент введения в среду метки в самом конце S-периода,первыми вступят в митоз, то, следовательно, в тех клетках, у которых S-периодначинается непосредственно перед удалением метки, меченые митотическиехромосомы появятся в последнюю очередь. Поэтому, если бы нам удалось определитьпромежуток между временем вступления в митоз клеток, помеченных первыми, иклеток, помеченных последними, мы установили бы продолжительность S-периода. Однако,хотя время, когда впервые появляются меченые митотические хромосомы, установитьлегко, время вступления в митоз клеток, помеченных последними, определитьневозможно (этому препятствует очень большое количество меченых делящихсяклеток в последних пробах). Поэтому продолжительность S-периодаприходится определять другим способом.

При исследованиирадиоавтографов последовательных проб клеток, отбираемых через одинаковыепромежутки времени, обнаруживается, что доля клеток, несущих метку в своихмитотических хромосомах, постепенно возрастает, пока мечеными не окажутсябуквально все делящиеся клетки. Однако, по мере того как клетки одна за другойзавершают митоз, они превращаются в меченые интерфазные клетки. Первымизавершают митоз те из меченых клеток, которые вступили в него первыми; исоответственно из клеток с мечеными митотическими хромосомами последнимизавершают митоз те, которые вступили в него позже всех. Посколькупродолжительность митоза всегда одинакова, то, следовательно, если бы мы моглиопределить промежуток между: 1) временем окончания митоза в клетках, включившихметку первыми, и 2) временем окончания митоза в клетках, включивших меткупоследними, мы установили бы продолжительность S-периода.Продолжительность S-периода нетрудно установить, определив промежутокмежду: 1) моментом времени, когда 50% митотических клеток в культуре несутметку, и 2) моментом времени, после которого культура уже не содержит 50%меченых клеток.

Определениевремени генерации (общей продолжительности всего клеточного цикла).

Продолжая отбирать из культурыпробы клеток, можно обнаружить, что меченые фигуры митоза в какой-то моментсовершенно исчезают, а затем появляются вновь. Такие делящиеся клеткипредставляют собой дочерние клетки, происходящие от тех материнских клеток,которые включили метку, находясь в момент воздействия тритий-тимидина в S-периоде. Этиматеринские клетки перешли в S-период, разделились, а затем прошличерез вторую интерфазу и второе деление, то есть проделали один полный цикл ичасть следующего. Время, необходимое для прохождения полного клеточного цикла,называется временем генерации. Оно соответствует промежутку между двумяпоследовательными пиками включения метки и обычно соответствует отрезку междутеми точками последовательных восходящих кривых, в которых 50% фигур митозасодержат метку.

Литература.

А.Хэм,Д.Кормак «Гистология», том 1 Москва «МИР» 1982;

М.Г.Абрамов«Клиническая цитология» Москва «МЕДИЦИНА» 1974;

Ю.С.Ченцов«Общая цитология»

Мурманский государственный технический университет

Кафедра биологии

Доклад на тему:

«Методы исследования в цитологии»

Выполнил:

Студентка 1-го курса

Технического факультета

Кафедры Биология

Серебрякова Лада Вячеславовна

Проверил:

Мурманск 2001

План:

1. Что изучает цитология.

2. Представление о том, что организмы состоят из клеток.

3. Методы исследования, применяемые в цитологии.

4. Фракционирование клеток.

5. Радиоавтография.

6. Определение продолжительности некоторых стадий клеточного цикла методом радиоавтографии.

Цитология – наука о клетке. Из среды других биологических наук она выделилась почти 100 лет назад. Впервые обобщенные сведения о строении клеток были собраны в книгу Ж.-Б. Карнуа «Биология клетки», вышедшей в 1884 году. Современная цитология изучает строение клеток, их функционирование как элементарных живых систем: исследуются функции отдельных клеточных компонентов, процессы воспроизведения клеток, их репарации, приспособление к условиям среды и многие другие процессы, позволяющие судить об общих для всех клеток свойствах и функциях. Цитология рассматривает также особенности строения специализированных клеток. Другими словами, современная цитология – это физиология клетки. Цитология тесно сопряжена с научными и методическими достижениями биохимии, биофизики, молекулярной биологии и генетики. Это послужило основанием для углубленного изучения клетки уже с позиций этих наук и появления некой синтетической науки о клетке – биологии клетки, или клеточной биологии. В настоящее время термины цитология и биология клетки совпадают, так как их предметом изучения является клетка с ее собственными закономерностями организации и функционирования. Дисциплина «Биология клетки» относится к фундаментальным разделам биологии, потому что она исследует и описывает единственную единицу всего живого на Земле – клетку.

Длительное и пристальное изучение клетки как таковой привело к формулированию важного теоретического обобщения, имеющего общебиологическое значение, а именно к появлению клеточной теории. В XVII в. Роберт Гук, физик и биолог, отличавшийся большой изобретательностью, создал микроскоп. Рассматривая под своим микроскопом тонкий срез пробки, Гук обнаружил, что она построена из малюсеньких ничем не заполненных ячеек, разделенных тонкими стенками, которые, как это нам теперь известно, состоят из целлюлозы. Он назвал эти маленькие ячейки клетками. В дальнейшем, когда другие биологи начали исследовать под микроскопом растительные ткани, оказалось, что маленькие ячейки, обнаруженные Гуком в мертвой иссохшей пробке, имеются и в живых растительных тканях, но у них они не пустые, а содержат каждая по маленькому студенистому тельцу. После того, как микроскопическому исследованию подвергли животные ткани, было установлено, что они также состоят из мелких студенистых телец, но что эти тельца лишь в редких случаях отделены друг от друга стенками. В результате всех этих исследований в 1939 г. Шлейден и Шванн независимо друг от друга сформулировали клеточную теорию, гласящую, что клетки представляют собой элементарные единицы, из которых в конечном счете построены все растения и все животные. В течение какого-то времени двоякий смысл слова клетка еще вызывал некоторые недоразумения, но затем он прочно закрепился за этими маленькими желеобразными тельцами.

Современное представление о клетке тесно связано с техническими достижениями и усовершенствованиями методов исследования. Помимо обычной световой микроскопии, не утратившей своей роли, в последние несколько десятилетий большое значение приобрели поляризационная, ультрафиолетовая, флюоресцентная, фазовоконтрастная микроскопия. Среди них особое место занимает электронная микроскопия, разрешающая способность которой позволила проникнуть и изучить субмикроскопическую и молекулярную структуру клетки. Современные методы исследования позволили вскрыть детальную картину клеточной организации.

Каждая клетка состоит из ядра и цитоплазмы, отделенных друг от друга и от внешней среды оболочками. Компонентами цитоплазмы являются: оболочка, гиалоплазма, эндоплазматическая сеть и рибосомы, аппарат Гольджи, лизосомы, митохондрии, включения, клеточный центр, специализированные органеллы.

Часть организма, выполняющая какую-то особую функцию, называют органом. Любой орган – легкое, печень, почка, например – имеет каждый свою особую структуру, благодаря которой он играет определенную роль в организме. Точно так же в цитоплазме имеются особые структуры, своеобразное строение которых дает им возможность нести определенные функции, необходимые для метаболизма клетки; эти структуры называют органеллами («маленькими органами»).

Выяснение природы, функции и распределения органелл цитоплазмы стало возможным лишь после развития методов современной биологии клетки. Наиболее полезными в этом отношении оказались: 1) электронная микроскопия; 2) фракционирование клеток, с помощью которого биохимики могут выделять относительно чистые фракции клеток, содержащие определенные органеллы, и изучать, таким образом, отдельные интересующие их метаболические реакции; 3) радиоавтография, сделавшая возможным непосредственное изучение отдельных метаболических реакций, протекающих в органеллах.

Метод, с помощью которого органеллы выделяют из клеток, называют фракционированием. Этот метод оказался очень плодотворным, дав биохимикам возможность выделять разные органеллы клетки в относительно чистом виде. Он позволяет, кроме того, определять химический состав органелл и содержащиеся в них ферменты и на основании получаемых данных делать выводы об их функциях в клетке. В качестве первого шага клетки разрушают путем гомогенизации в какой-нибудь подходящей среде, которая обеспечивает сохранность органелл и предотвращает их агрегацию. Очень часто для этого используют раствор сахарозы. Хотя митохондрии и многие другие клеточные органеллы остаются при этом неповрежденными, такие мембранные переплетения, как эндоплазматический ретикулум, а также плазматическая мембрана, распадаются на фрагменты. Однако образующиеся фрагменты мембран нередко замыкаются сами на себя, в результате чего получаются округлые пузырьки различных размеров.

На следующем этапе клеточный гомогенат подвергают ряду центрифугирований, скорость и продолжительность которых всякий раз возрастает; этот процесс называется дифференциальным центрифугированием. Разные органеллы клетки осаждаются на дне центрифужных пробирок при различных скоростях центрифугирования, что зависит от размеров, плотности и формы органелл. Образующийся осадок можно отобрать и исследовать. Быстрее всех осаждаются такие крупные и плотные структуры, как ядра, а для осаждения более мелких и менее плотных структур, таких, как пузырьки эндоплазматического ретикулума, требуются более высокие скорости и более длительное время. Поэтому при низких скоростях центрифугирования ядра осаждаются, а другие клеточные органеллы остаются в суспензии. При более высоких скоростях осаждаются митохондрии и лизосомы, а при длительном центрифугировании и очень высоких скоростях в осадок выпадают даже такие мелкие частицы, как рибосомы. Осадки можно исследовать с помощью электронного микроскопа, чтобы определить чистоту полученных фракций. Все фракции до некоторой степени загрязнены другими органеллами. Если тем не менее удается добиться достаточной чистоты фракций, то их подвергают затем биохимическому анализу, чтобы определить химический состав и ферментативную активность выделенных органелл.

Сравнительно недавно был создан другой метод фракционирования клеток – центрифугирование в градиенте плотности; при этом центрифугирование производят в пробирке, в которой предварительно наслаивают друг на друга растворы сахарозы все возрастающей концентрации, а следовательно, и возрастающей плотности. При центрифугировании содержащиеся в гомогенате органеллы располагаются в центрифужной пробирке на тех уровнях, на которых находятся растворы сахарозы, соответствующие им по плотности. Этот метод дает биохимикам возможность разделять органеллы одинаковых размеров, но разной плотности (рис. 1.).

Радиоавтография – сравнительно новый метод, безмерно расширивший возможности как световой, так и электронной микроскопии. Это в высшей степени современный метод, обязанный своим возникновением развитию ядерной физики, которое сделало возможным получение радиоактивных изотопов различных элементов. Для радиоавтографии необходимы, в частности, изотопы тех элементов, которые используются клеткой или могут связываться с веществами, используемыми клеткой, и которые можно вводить животным или добавлять к культурам в количествах, не нарушающих нормального клеточного метаболизма. Поскольку радиоактивный изотоп (или помеченное им вещество) участвует в биохимических реакциях так же, как его нерадиоактивный аналог, и в то же время испускает излучение, путь изотопов в организме можно проследить с помощью различных методов обнаружения радиоактивности. Один из способов обнаружения радиоактивности основан на ее способности действовать на фотопленку подобно свету; но радиоактивное излучение проникает сквозь черную бумагу, используемую для того, чтобы защитить фотопленку от света, и оказывает на пленку такое же действие, как свет.

Чтобы на препаратах, предназначенных для изучения с помощью светового или электронного микроскопов, можно было обнаружить излучение, испускаемое радиоактивными изотопами, препараты покрывают в темном помещении особой фотоэмульсией, после чего оставляют на некоторое время в темноте. Затем препараты проявляют (тоже в темноте) и фиксируют. Участки препарата, содержащие радиоактивные изотопы, воздействуют на лежащую над ними эмульсию, в которой под действием испускаемого излучения возникают темные «зерна». Таким образом, получают радиоавтографы (от греч. радио – лучевидный, аутос – сам и графо – писать).

Вначале гистологи располагали лишь несколькими радиоактивными изотопами; так, например, во многих ранних исследованиях с применением радиоавтографии использовался радиоактивный фосфор. Позднее стали использовать значительно больше таких изотопов; особенно широкое применение нашел радиоактивный изотоп водорода – тритий.

Радиоавтография имела и имеет до сих пор очень широкое применение для изучения того, где и как в организме протекают те или иные биохимические реакции.

Химические соединения, меченые радиоактивными изотопами, которые используются для исследования биологических процессов, называют предшественниками. Предшественники – это обычно вещества, подобные тем, которые организм получает из пищи; они служат строительными блоками для построения тканей и включаются в сложные компоненты клеток и тканей таким же образом, как в них включаются немеченые строительные блоки. Компонент ткани, в который включается меченый предшественник и который испускает излучение, называется продуктом.

Клетки, выращиваемые в культуре, хотя и принадлежат к одному и тому же типу, в любой данный момент времени будут находиться на разных стадиях клеточного цикла, если не принять специальных мер для синхронизации их циклов. Тем не менее, путем введения в клетки тритий-тимидина и последующего изготовления радиоавтографов можно определить продолжительность различных стадий цикла. Время наступления одной стадии – митоза – можно определить и без меченого тимидина. Для этого выборку клеток из культуры держат под наблюдением в фазово-контрастном микроскопе, который дает возможность непосредственно следить за течением митоза и устанавливать его сроки. Продолжительность митоза обычно равна 1 ч, хотя в клетках некоторых типов он занимает до 1.5 ч.

G 2-периода .

Для определения продолжительности G 2–периода применяют метод, известный под названием импульсной метки: к культуре клеток добавляют меченый тимидин, а спустя короткое время заменяют культуральную среду свежей, с тем, чтобы предотвратить дальнейшее поглощение клетками меченого тимидина. При этом метку включают только в те клетки, которые в течение кратковременного пребывания в среде с тритий-тимидином находились в S -периоде клеточного цикла. Доля таких клеток невелика и лишь небольшая часть клеток получит метку. Кроме того, все клетки, включающие метку, будут находиться в интерфазе – от клеток, едва вступивших в S -период, до таких, которые почти закончили его за время воздействия тритий-тимидина. В пробе, взятой сразу после удаления меченого тимидина, метка содержится только в интерфазных ядрах, принадлежащих клеткам, которые в период воздействия метки находились в S -периоде; те же клетки, которые в этот период находились в состоянии митоза, остаются немечеными.

Если затем продолжать отбирать из культуры пробы через определенные промежутки времени и изготовлять для каждой последовательной пробы радиоавтограф, то наступит момент, когда метка начнет появляться в митотических d -хромосомах . Метки будут включаться во все те клетки, которые в период наличия в среде тритий-тимидина находились в S -периоде, причем среди этих клеток будут как только что вступившие в S -период, так и почти закончившие его. Совершенно очевидно, что эти последние первыми среди меченых клеток проделают митоз и, следовательно, в их митотических хромосомах обнаружится метка. Тем самым промежуток между 1) временем, когда из культуры был удален меченый тимидин, и 2) временем появления меченых митотических хромосом будет соответствовать продолжительности G 2–периода клеточного цикла.

Определение продолжительности S -периода .

Поскольку клетки, находящиеся в момент введения в среду метки в самом конце S -периода, первыми вступят в митоз, то, следовательно, в тех клетках, у которых S -период начинается непосредственно перед удалением метки, меченые митотические хромосомы появятся в последнюю очередь. Поэтому, если бы нам удалось определить промежуток между временем вступления в митоз клеток, помеченных первыми, и клеток, помеченных последними, мы установили бы продолжительность S -периода. Однако, хотя время, когда впервые появляются меченые митотические хромосомы, установить легко, время вступления в митоз клеток, помеченных последними, определить невозможно (этому препятствует очень большое количество меченых делящихся клеток в последних пробах). Поэтому продолжительность S -периода приходится определять другим способом.

При исследовании радиоавтографов последовательных проб клеток, отбираемых через одинаковые промежутки времени, обнаруживается, что доля клеток, несущих метку в своих митотических хромосомах, постепенно возрастает, пока мечеными не окажутся буквально все делящиеся клетки. Однако, по мере того как клетки одна за другой завершают митоз, они превращаются в меченые интерфазные клетки. Первыми завершают митоз те из меченых клеток, которые вступили в него первыми; и соответственно из клеток с мечеными митотическими хромосомами последними завершают митоз те, которые вступили в него позже всех. Поскольку продолжительность митоза всегда одинакова, то, следовательно, если бы мы могли определить промежуток между: 1) временем окончания митоза в клетках, включивших метку первыми, и 2) временем окончания митоза в клетках, включивших метку последними, мы установили бы продолжительность S -периода. Продолжительность S -периода нетрудно установить, определив промежуток между: 1) моментом времени, когда 50% митотических клеток в культуре несут метку, и 2) моментом времени, после которого культура уже не содержит 50% меченых клеток.

Определение времени генерации (общей продолжительности всего клеточного цикла).

Продолжая отбирать из культуры пробы клеток, можно обнаружить, что меченые фигуры митоза в какой-то момент совершенно исчезают, а затем появляются вновь. Такие делящиеся клетки представляют собой дочерние клетки, происходящие от тех материнских клеток, которые включили метку, находясь в момент воздействия тритий-тимидина в S -периоде. Эти материнские клетки перешли в S -период, разделились, а затем прошли через вторую интерфазу и второе деление, то есть проделали один полный цикл и часть следующего. Время, необходимое для прохождения полного клеточного цикла, называется временем генерации. Оно соответствует промежутку между двумя последовательными пиками включения метки и обычно соответствует отрезку между теми точками последовательных восходящих кривых, в которых 50% фигур митоза содержат метку.

Литература.

А.Хэм, Д.Кормак «Гистология», том 1 Москва «МИР» 1982;

М.Г.Абрамов «Клиническая цитология» Москва «МЕДИЦИНА» 1974;

Ю.С.Ченцов «Общая цитология»

Содержание статьи

ЦИТОЛОГИЯ, наука о клетках – структурных и функциональных единицах почти всех живых организмов. В многоклеточном организме все сложные проявления жизни возникают в результате координированной активности составляющих его клеток. Задача цитолога – установить, как построена живая клетка и как она выполняет свои нормальные функции. Изучением клеток занимаются также патоморфологи, но их интересуют изменения, происходящие в клетках во время болезни или после смерти. Несмотря на то что учеными давно уже было накоплено немало данных о развитии и строении животных и растений, только в 1839 были сформулированы основные концепции клеточной теории и началось развитие современной цитологии.

Клетки - это самые мелкие единицы живого, о чем наглядно свидетельствует способность тканей распадаться на клетки, которые затем могут продолжать жить в «тканевой» или клеточной культуре и размножаться подобно крошечным организмам. Согласно клеточной теории, все организмы состоят из одной или многих клеток. Из этого правила есть несколько исключений. Например, в теле слизевиков (миксомицетов) и некоторых очень мелких плоских червей клетки не отделены друг от друга, а образуют более или менее слитную структуру – т.н. синцитий. Однако можно считать, что такое строение возникло вторично в результате разрушения участков клеточных мембран, имевшихся у эволюционных предков этих организмов. Многие грибы растут, образуя длинные нитевидные трубки, или гифы. Эти гифы, часто разделенные перегородками – септами – на сегменты, тоже можно рассматривать как своеобразные вытянутые клетки. Из одной клетки состоят тела протистов и бактерий.

Между бактериальными клетками и клетками всех других организмов существует одно важное различие: ядра и органеллы («маленькие органы») бактериальных клеток не окружены мембранами, и поэтому эти клетки называют прокариотическими («доядерными»); все другие клетки называют эукариотическими (с «настоящими ядрами»): их ядра и органеллы заключены в мембраны. В этой статье рассматриваются только эукариотические клетки.

Открытие клетки.

Изучение мельчайших структур живых организмов стало возможным лишь после изобретения микроскопа, т.е. после 1600. Первое описание и изображения клеток дал в 1665 английский ботаник Р.Гук: рассматривая тонкие срезы высушенной пробки, он обнаружил, что они «состоят из множества коробочек». Каждую из этих коробочек Гук назвал клеткой («камерой»). Итальянский исследователь М.Мальпиги (1674), голландский ученый А. ван Лёвенгук, а также англичанин Н.Грю (1682) вскоре привели множество данных, демонстрирующих клеточное строение растений. Однако ни один из этих наблюдателей не понял, что действительно важным веществом был наполнявший клетки студенистый материал (впоследствии названный протоплазмой), а казавшиеся им столь важными «клетки» были просто безжизненными целлюлозными коробочками, в которых содержалось это вещество. До середины 19 в. в трудах ряда ученых уже просматривались зачатки некой «клеточной теории» как общего структурного принципа. В 1831 Р.Броун установил существование в клетке ядра, но не сумел оценить всю важность своего открытия. Вскоре после открытия Броуна несколько ученых убедились в том, что ядро погружено в полужидкую протоплазму, заполняющую клетку. Первоначально основной единицей биологической структуры считали волокно. Однако уже в начале 19 в. почти все стали признавать непременным элементом растительных и животных тканей структуру, которую называли пузырьком, глобулой или клеткой.

Создание клеточной теории.

Количество прямых сведений о клетке и ее содержимом чрезвычайно возросло после 1830, когда появились усовершенствованные микроскопы. Затем в 1838–1839 произошло то, что называют «завершающим мазком мастера». Ботаник М.Шлейден и анатом Т.Шванн практически одновременно выдвинули идею клеточного строения. Шванн предложил термин «клеточная теория» и представил эту теорию научному сообществу. Согласно клеточной теории, все растения и животные состоят из сходных единиц – клеток, каждая из которых обладает всеми свойствами живого. Эта теория стала краеугольным камнем всего современного биологического мышления.

Открытие протоплазмы.

Сначала незаслуженно большое внимание уделяли стенкам клетки. Однако еще Ф.Дюжарден (1835) описал живой студень у одноклеточных организмов и червей, назвав его «саркодой» (т.е. «похожим на мясо»). Эта вязкая субстанция была, по его мнению, наделена всеми свойствами живого. Шлейден тоже обнаружил в растительных клетках мелкозернистое вещество и назвал его «растительной слизью» (1838). Спустя 8 лет Г.фон Моль воспользовался термином «протоплазма» (примененным в 1840 Я.Пуркинье для обозначения субстанции, из которой формируются зародыши животных на ранних стадиях развития) и заменил им термин «растительная слизь». В 1861 М.Шультце обнаружил, что саркода содержится также в тканях высших животных и что это вещество идентично как структурно, так и функционально т.н. протоплазме растений. Для этой «физической основы жизни», как определил ее впоследствии Т.Гексли, был принят общий термин «протоплазма». Концепция протоплазмы в свое время сыграла важную роль; однако уже давно стало ясно, что протоплазма не однородна ни по своему химическому составу, ни по структуре, и этот термин постепенно вышел из употребления. В настоящее время главными компонентами клетки обычно считают ядро, цитоплазму и клеточные органеллы. Сочетание цитоплазмы и органелл практически соответствует тому, что имели в виду первые цитологи, говоря о протоплазме.

Основные свойства живых клеток.

Изучение живых клеток пролило свет на их жизненно важные функции. Было установлено, что последние можно разбить на четыре категории: подвижность, раздражимость, метаболизм и размножение.

Подвижность проявляется в различных формах: 1) внутриклеточная циркуляция содержимого клетки; 2) перетекание, обеспечивающее перемещение клеток (например, клеток крови); 3) биение крошечных протоплазматических выростов – ресничек и жгутиков; 4) сократимость, наиболее развитая у мышечных клеток.

Раздражимость выражается в способности клеток воспринимать стимул и реагировать на него импульсом, или волной возбуждения. Эта активность выражена в наивысшей степени у нервных клеток.

Метаболизм включает все превращения вещества и энергии, протекающие в клетках.

Размножение обеспечивается способностью клетки к делению и образованию дочерних клеток. Именно способность воспроизводить самих себя и позволяет считать клетки мельчайшими единицами живого. Однако многие высокодифференцированные клетки эту способность утратили.

ЦИТОЛОГИЯ КАК НАУКА

В конце 19 в. главное внимание цитологов было направлено на подробное изучение строения клеток, процесса их деления и выяснение их роли как важнейших единиц, обеспечивающих физическую основу наследственности и процесса развития.

Развитие новых методов.

Вначале при изучении деталей строения клеток приходилось полагаться главным образом на визуальное исследование мертвого, а не живого материала. Необходимы были методы, которые позволяли бы сохранять протоплазму, не повреждая ее, изготавливать достаточно тонкие срезы ткани, проходящие и через клеточные компоненты, а также окрашивать срезы, чтобы выявлять детали клеточного строения. Такие методы создавались и совершенствовались в течение всей второй половины 19 в. Совершенствовался и сам микроскоп. К числу важных достижений в его устройстве следует отнести: осветитель, расположенный под столиком, для фокусировки пучка света; апохроматический объектив для корректировки недостатков окрашивания, искажающих изображение; иммерсионный объектив, дающий более четкое изображение и увеличение в 1000 раз и более.

Было также обнаружено, что основные красители, например гематоксилин, обладают сродством к содержимому ядра, а кислотные красители, например эозин, окрашивают цитоплазму; это наблюдение послужило основой для создания разнообразных методов контрастного или дифференциального окрашивания. Благодаря этим методам и усовершенствованным микроскопам постепенно накапливались важнейшие сведения о строении клетки, ее специализированных «органах» и различных неживых включениях, которые клетка либо сама синтезирует, либо поглощает извне и накапливает.

Закон генетической непрерывности.

Фундаментальное значение для дальнейшего развития клеточной теории имела концепция генетической непрерывности клеток. В свое время Шлейден считал, что клетки образуются в результате своего рода кристаллизации из клеточной жидкости, а Шванн в этом ошибочном направлении пошел еще дальше: по его мнению, клетки возникали из некой «бластемной» жидкости, находящейся вне клеток.

Сначала ботаники, а затем и зоологи (после того как разъяснились противоречия в данных, полученных при изучении некоторых патологических процессов) признали, что клетки возникают только в результате деления уже существующих клеток. В 1858 Р.Вирхов сформулировал закон генетической непрерывности в афоризме «Omnis cellula e cellula» («Каждая клетка из клетки»). Когда была установлена роль ядра в клеточном делении, В.Флемминг (1882) перефразировал этот афоризм, провозгласив: «Omnis nucleus e nucleo» («Каждое ядро из ядра»). Одним из первых важных открытий в изучении ядра было обнаружение в нем интенсивно окрашивающихся нитей, названных хроматином. Последующие исследования показали, что при делении клетки эти нити собираются в дискретные тельца – хромосомы, что число хромосом постоянно для каждого вида, а в процессе клеточного деления, или митоза, каждая хромосома расщепляется на две, так что каждая клетка получает типичное для данного вида число хромосом. Следовательно, афоризм Вирхова можно распространить и на хромосомы (носители наследственных признаков), поскольку каждая из них происходит от предсуществующей.

В 1865 было установлено, что мужская половая клетка (сперматозоид, или спермий) представляет собой полноценную, хотя и высокоспециализированную клетку, а спустя 10 лет О.Гертвиг проследил путь сперматозоида в процессе оплодотворения яйцеклетки. И наконец, в 1884 Э. ван Бенеден показал, что в процессе образования как сперматозоида, так и яйцеклетки происходит модифицированное клеточное деление (мейоз), в результате которого они получают по одному набору хромосом вместо двух. Таким образом, каждый зрелый сперматозоид и каждая зрелая яйцеклетка содержат лишь половинное число хромосом по сравнению с остальными клетками данного организма, и при оплодотворении происходит просто восстановление нормального числа хромосом. В итоге оплодотворенная яйцеклетка содержит по одному набору хромосом от каждого из родителей, что является основой для наследования признаков и по отцовской, и по материнской линии. Кроме того, оплодотворение стимулирует начало дробления яйцеклетки и развитие нового индивида.

Представление о том, что хромосомы сохраняют свою идентичность и поддерживают генетическую непрерывность от одного поколения клеток к другому, окончательно сформировалось в 1885 (Рабль). Вскоре было установлено, что хромосомы качественно отличаются друг от друга по своему влиянию на развитие (Т.Бовери, 1888). Начали появляться также экспериментальные данные в пользу высказанной ранее гипотезы В.Ру (1883), согласно которой даже отдельные части хромосом влияют на развитие, структуру и функционирование организма.

Таким образом, еще до конца 19 в. было сделано два важных заключения. Одно состояло в том, что наследственность есть результат генетической непрерывности клеток, обеспечиваемой клеточным делением. Другое – что существует механизм передачи наследственных признаков, который находится в ядре, а точнее – в хромосомах. Было установлено, что благодаря строгому продольному расщеплению хромосом дочерние клетки получают совершенно такую же (как качественно, так и количественно) генетическую конституцию, как исходная клетка, от которой они произошли.

Законы наследственности.

Второй этап в развитии цитологии как науки охватывает 1900–1935. Он наступил после того, как в 1900 были вторично открыты основные законы наследственности, сформулированные Г.Менделем в 1865, но не привлекшие к себе внимания и надолго преданные забвению. Цитологи, хотя и продолжали заниматься изучением физиологии клетки и такими ее органеллами, как центросома, митохондрии и аппарат Гольджи, основное внимание сосредоточили на строении хромосом и их поведении. Проводившиеся в это же время эксперименты по скрещиванию быстро увеличивали объем знаний о способах наследования, что привело к становлению современной генетики как науки. В результате возник «гибридный» раздел генетики – цитогенетика.

ДОСТИЖЕНИЯ СОВРЕМЕННОЙ ЦИТОЛОГИИ

Новые методы, особенно электронная микроскопия, применение радиоактивных изотопов и высокоскоростного центрифугирования, появившиеся после 1940-х годов, позволили достичь огромных успехов в изучении строения клетки. В разработке единой концепции физико-химических аспектов жизни цитология все больше сближается с другими биологическими дисциплинами. При этом ее классические методы, основанные на фиксации, окрашивании и изучении клеток под микроскопом, по-прежнему сохраняют практическое значение.

Цитологические методы используются, в частности, в селекции растений для определения хромосомного состава растительных клеток. Такие исследования оказывают большую помощь в планировании экспериментальных скрещиваний и оценке полученных результатов. Аналогичный цитологический анализ проводится и на клетках человека: он позволяет выявить некоторые наследственные заболевания, связанные с изменением числа и формы хромосом. Такой анализ в сочетании с биохимическими тестами используют, например, при амниоцентезе для диагностики наследственных дефектов плода. НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ.

Однако самое важное применение цитологических методов в медицине – это диагностика злокачественных новообразований. В раковых клетках, особенно в их ядрах, возникают специфические изменения, распознаваемые опытными патоморфологами.